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Después de la transferencia por Western blot, la membrana se prepara para la detección de proteínas a través de una serie de pasos de incubación y lavado. El bloqueo es el primer paso, donde una proteína no reactiva recubre la membrana para evitar la unión de anticuerpos no específicos. Las membranas de nitrocelulosa y PVDF son ideales para una alta afinidad de unión de proteínas. Esto previene señales de fondo altas que pueden obstaculizar la detección de proteínas. El tampón de bloqueo generalmente contiene proteínas no reactivas como BSA, leche desnatada o suero, y solución salina tamponada con Tris o fosfato con detergente Tween-20.
